Autor | Retornar ao parque
Na noite de 7 de outubro, horário de Pequim, o Prêmio Nobel de Química de 2020 foi concedido a Emmanuelle Charpentier e Jennifer A. Doudna por suas contribuições para a edição de genes.
A Dra. Emmanuelle Charpentier, microbiologista francesa, é atualmente diretora do Instituto de Biologia de Infecções do Instituto Max Planck na Alemanha. No desenvolvimento do CRISPR, sua principal contribuição é descobrir que a atividade da proteína Cas9 depende do tracrRNA.
Dra. Jennifer A. Doudna é professora de química e biologia molecular e biologia celular na Universidade de Berkeley, pesquisadora do Howard Hughes Medical Institute e membro da National Academy of Sciences. Ela e a Dra. Emmanuelle Charpentier descobriram em conjunto a clivagem de Cas9 e o posicionamento de crRNA, e a fusão de crRNA e tracrRNA em RNA guia de fita simples (sgRNA).
Especialistas em áreas relacionadas analisaram que o cientista chinês Zhang Feng usou pela primeira vez o CRISPR-Cas9 para implementar a edição de genes em células eucarióticas, mas não conseguiu ganhar o prêmio. Pode ser porque o trabalho de Zhang Feng é menos original e suas contribuições são mais semelhantes às células originais. A contribuição de Cohen e Boyer na reorganização (o Prêmio de Química de 1980 foi dado a Berg pela reorganização artificial); e o Prêmio de Química dá mais atenção aos resultados de experimentos in vitro, e seus avanços são refletidos principalmente na célula.
O CRISPR é agora uma tecnologia de edição de genes muito popular na biomedicina. O rápido desenvolvimento dessa tecnologia nos últimos anos foi popularizado e aplicado a muitos campos, como biologia, medicina, agricultura e meio ambiente, criando lotes de milagres científicos, especialmente em O tratamento de doenças genéticas, o rastreio e teste de genes relacionados com doenças, o tratamento de tumores, a transformação de animais e plantas e a prevenção e tratamento de microrganismos patogénicos têm um grande potencial e terão um impacto profundo em todo o mundo.
O nome completo de CRISPR é Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, que se traduz em "curtas repetições palindrômicas regularmente agrupadas" em chinês. O significado literal desta palavra é "representar o mesmo tipo de sequência repetitiva com características óbvias, bem organizadas e em ordem consistente". Ela atua como o sistema imunológico adaptativo das bactérias. Quando um vírus estranho ou DNA de plasmídeo entra na célula, a proteína Cas especializada corta o DNA estranho em pequenos fragmentos e os cola em seus próprios fragmentos de DNA para armazenamento. Quando encontra uma invasão de vírus novamente, a bactéria pode reconhecer o vírus de acordo com os fragmentos armazenados e cortar o DNA do vírus para torná-lo inválido .
Os cientistas usam essa função do CRISPR para transformá-lo em uma nova ferramenta molecular revolucionária. Por ter a capacidade de localizar e cortar com precisão qualquer tipo de material genético, torna mais fácil para os cientistas decifrar o código de vida de qualquer criatura na Terra (incluindo humanos).
Figura 1: Uma breve história do desenvolvimento do CRISPR
Já em 1987, o grupo de pesquisa Nakata da Universidade de Osaka, no Japão, descobriu que havia algumas sequências anormalmente repetidas na bactéria ao analisar E. coli . Mas, naquela época, as pessoas não sabiam exatamente o que essas sequências repetidas tinham, e eles nem mesmo tinham denominado formalmente essas sequências repetidas. Foi somente no final da década de 1980 que Francisco Mojica, da Universidade de Alicante, Espanha, mais uma vez encontrou uma sequência repetitiva semelhante em uma espécie de archaeal. , O que despertou seu grande interesse. Em pesquisas subsequentes, ele procurou estruturas semelhantes em microrganismos.Em 2000, ele havia encontrado essa sequência semelhante em mais de 20 espécies diferentes de microrganismos. . Em 2002, Ruud Jansen, da Universidade de Utrecht, na Holanda, descobriu que existem enormes diferenças no número de bases em sequências repetitivas de diferentes espécies, e essa sequência só existe em procariotos. A fim de padronizar melhor as pesquisas relacionadas, eles denominaram essa sequência repetitiva de "CRISPR". . Vários genes relacionados ao CRISPR são chamados de família Cas (associados ao CRISPR) .
Em 2005, a pesquisa do CRISPR deu início a uma importante descoberta: os dois grupos de pesquisa (Mojica e Pourcel) observaram que a sequência espaçadora entre as repetições do CRISPR não provinha do próprio procarioto, mas de um plasmídeo ou vírus. . Portanto, Mojica propôs a hipótese de que CRISPR é um sistema imune adaptativo. No mesmo ano, a equipe do Bolotin descobriu Cas9 em Streptococcus thermophilus e previu que essa enorme proteína tinha atividade de nuclease. Eles também descobriram que as sequências espaçadoras homólogas ao vírus possuem uma cauda semelhante, denominada sequências PAM (protospacer adjacente motif), que são essenciais para o reconhecimento das sequências alvo.
Motivado por essa hipótese, o microbiologista francês Rodolphe Barragou, que ainda trabalhava na famosa empresa de iogurte Danisco, decidiu verificá-la para resolver o problema do surto de Streptococcus thermophilus, infecção fágica e morte que afetava a produção de iogurte. Em 2007, eles provaram por meio de experimentos que o sistema CRISPR é de fato um sistema imunológico adaptativo. Depois de ser invadido por um vírus, o Streptococcus thermophilus integra uma nova sequência espaçadora do genoma do fago. Quando o mesmo vírus invadir novamente, a bactéria terá a capacidade de resistir ao ataque A proteína Cas9 pode ser necessária para essa imunidade. Esta é a primeira confirmação experimental de que CRISPR-Cas é um sistema imunológico adquirido por bactérias.
A confirmação da função biológica do CRISPR-CAS fez com que muitas equipes de pesquisa percebessem a importância desse sistema e, então, muitas equipes de pesquisa começaram a complementar os detalhes do mecanismo de interferência do sistema CRISPR-Cas com o fago. Em 2008, a equipe de pesquisa de John van der Oost descobriu em Escherichia coli que a sequência espaçadora do fago foi transcrita em um pequeno RNA, chamado CRISPR RNA (crRNA), e guiou a proteína Cas até o DNA alvo. No mesmo ano, Marraffini e Sontheimer provaram que a molécula alvo do sistema CRISPR-Cas é o DNA, não o RNA. Eles também apontaram claramente que se o sistema for transferido para um sistema não bacteriano, pode se tornar um sistema de ferramenta poderoso . Isso lançou as bases para a edição subsequente de genes.
Em dezembro de 2010, a equipe de Moineau provou que a clivagem precisa de CRISRP-Cas9 a montante da sequência PAM causou quebras de fita dupla de DNA. Como uma característica significativa do sistema CRISPR tipo II, Cas9 é a única proteína necessária para o corte e medeia a função de interferência de CRISPR-Cas9 junto com crRNAs .
Em 2011, a equipe de pesquisa de Charpentier realizou um pequeno sequenciamento de RNA em Streptococcus pyogenes e descobriu que, além do crRNA, há também um pequeno RNA chamado de RNA CRISPR ativado de tipo (tracrRNA). tracrRNA guia Cas9 para o DNA alvo por emparelhamento complementar de 24 nucleotídeos com sequências repetitivas em crRNA e formando uma fita dupla. Neste ponto, o quebra-cabeça do mecanismo de interferência CRISPR-Cas9 natural está basicamente montado .
Em 2012, a equipe de Charpentier e Doudna cooperou, não só provou que Cas9 tem a capacidade de cortar DNA de fita dupla, mas também pode ligar tracrRNA e crRNA em sgRNA (RNA guia único), e experimentos in vitro confirmaram que sgRNA também pode guiar a proteína Cas9 para completar DNA A tesoura dupla-fita. Eles podem controlar o local de direcionamento de Cas9 alterando a sequência de crRNA . A equipe Siksnys posteriormente relatou as mesmas descobertas. Esta descoberta não é apenas um marco no campo do sistema imunológico adquirido por bactérias, mas também abriu um novo capítulo na tecnologia de edição de genes CRISPR-CAS. Logo, muitos artigos no início de 2013 aplicaram com sucesso o sistema CRISPR-Cas a células de mamíferos. Entre eles, o grupo de pesquisa da Igreja projetou um sistema CRISPR-Cas tipo II, que teve como alvo sequências específicas ao projetar sgRNAs em células 293T humanas, células K562 e células-tronco pluripotentes induzidas, e vários gRNAs podem realizar várias edições de genes alvo . O laboratório de Zhang Feng provou que o sistema CRISPR-Cas9 pode realizar o corte específico do local preciso em células humanas e de camundongo, e Cas9 mutado em uma enzima de corte para promover o processo de reparo de homologia . O grupo de pesquisa Qi estabeleceu o sistema CRISPRi e realizou mutagênese dirigida ao local simultânea de múltiplos sgRNAs direcionados a múltiplos genes (Tet1, Tet2, Tet3, Sry e Uty) . Wu et al. Usaram o sistema CRISPR-Cas9 para realizar terapia gênica em camundongos com mutações Crygc dominantes para obter uma prole saudável, fornecendo uma base para o sistema CRISPR-Cas9 para terapia gênica de doenças genéticas .
Como resultado, a pesquisa e a aplicação do sistema CRISPR nas áreas de edição direcionada a genes, triagem de genoma, regulação da transcrição de genes, imagens de composição de genes, diagnóstico e tratamento de genes e aplicações ecológicas em uma variedade de organismos começaram a explodir. Nos anos seguintes, o laboratório de Zhang Feng expandiu o sistema de edição de genes CRISPR-CAS, e não apenas descobriu o sistema CRISPR-Cas, que apresenta grandes vantagens na edição específica e multi-gene: CRISPR-Cpf1 , A enzima CRISPR Cas13a (C2c2) com função RNase também foi encontrada E Cas13b . Em 2017, muitos foram os artigos estudando o mecanismo de ação do sistema CRISPR-Cas13, sua aplicação no diagnóstico clínico e sua capacidade de direcionar o RNA em células de mamíferos.
O rápido desenvolvimento da tecnologia CRISPR cria continuamente surpresas em sua aplicação na medicina translacional e no tratamento de doenças. Em 2015, a Science publicou um método para usar o CRISPR com sucesso no tratamento de modelos animais de doenças genéticas. Eles usaram o sistema CRISPR para editar o gene da distrofina, que pode reparar a função muscular de camundongos com distrofia muscular de Duchenne em vários graus, alcançando assim o efeito de tratar DMD . Em 2018, um estudo confirmou que a tecnologia CRISPR foi usada para tratar com sucesso quatro cães com DMD (distrofia muscular de Duchenne) e restaurar a distrofina em seus músculos e tecido cardíaco para 92% do nível normal. . Além disso, a tecnologia CRISPR também é combinada com a imunoterapia celular para completar a terapia CAR-T e aumentar a supressão do tumor em camundongos. O primeiro ensaio clínico usando CRISPR-Cas9 para eliminar o gene PD-1 em células T foi aprovado para o tratamento de câncer de bexiga invasivo ao músculo, câncer de próstata resistente à castração, câncer de rim metastático e câncer de pulmão de células não pequenas metastático. Os ensaios clínicos de Fase I começaram em 2016 .
Atualmente, o CRISPR não é usado apenas na edição do genoma, mas também apresenta grande potencial em testes genéticos. Em um estudo publicado pela Science em 2017, a equipe de Doudna descobriu um fenômeno interessante: quando o sistema CRISPR corta o DNA de fita dupla direcionado, a atividade de DNase de Cas12 é ativada. . Esta descoberta fornece uma nova ideia para detectar se um determinado DNA alvo está contido em uma célula: entregar simultaneamente um sistema CRISPR-Cas12a direcionado ao DNA e um gene repórter fluorescente ssDNA não específico (repórter marcado com FQ) na célula, uma vez que o alvo seja detectado O DNA, o sistema CRISPR-Cas12a será ativado e, ao mesmo tempo, o gene repórter fluorescente também será degradado para liberar um sinal fluorescente. Usando essa tecnologia, a equipe de Doudna desenvolveu o sistema DETECTR, que pode detectar a infecção pelo HPV 16 com 100% de precisão em uma hora, e o custo de um único teste é inferior a um dólar. Ao mesmo tempo, a equipe de Zhang Feng também desenvolveu o sistema SHERLOCK e o sistema SHERLOCKv2 usando CRISPR-Cas13a Ao contrário da equipe de Doudna, o gene repórter fluorescente projetado pela equipe de Feng Zhang deve ser específico.É a vantagem da "especificidade" que permite ao SHERLOCKv2 detectar várias sequências ao mesmo tempo. A equipe de Zhang Feng também desenvolveu um método de teste de tira de teste semelhante a um teste de gravidez. Com apenas uma tira de teste, SHERLOCKv2 pode mostrar os resultados do teste de infecção de vírus, o que torna o teste mais conveniente. No desenvolvimento da tecnologia de detecção do COVID-19 este ano, o SHERLOCKv2 também mostrou seus talentos.
Embora o DETECTR e o SHERLOCK tenham nos mostrado seu poder no diagnóstico, os pesquisadores ainda precisam fazer muito trabalho para garantir a precisão do diagnóstico antes de entrar no uso clínico. Acreditamos que essas novas ferramentas de diagnóstico irão reescrever futuras técnicas de diagnóstico, especialmente para países em desenvolvimento com condições sanitárias relativamente precárias e altos níveis de infecção viral no diagnóstico de infecções virais. .
referências
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